Вона проходила від Радянської площі (зараз на цьому місці знаходиться сквер біля Вічного вогню) по вул. Університетській, Спартаківському провулку, площі Тевелєва (зараз - пл. Конституції) та вулиці Карла Лібкнехта (зараз - вул. Сумська) до парку ім. Горького (зараз - Центральний парк).
Для обслуговування лінії було придбано 10 тролейбусів. Перше тимчасове тролейбусне депо було збудоване на місці Дзеркального струменю. За рік лінія була продовжена до Південного вокзалу, а кількість тролейбусів збільшилася до 27-ми.
У 1941 році під час наступу німецьких військ тролейбуси були серйозно пошкоджені. Відновити їх роботу вдалося лише в травні 1944 року.
У 1960-70-ті роки довжина контактної мережі зросла майже втричі. Тоді були збудовані тролейбусні депо №2 та №3, які обслуговують містян і сьогодні.
З 2019 року почалося суттєве оновлення рухомого складу: місто отримало понад 130 сучасних одиниць транспорту. За кількістю тролейбусів з автономним ходом Харків посідає перше місце в Україні.
Через початок повномасштабного вторгнення в лютому 2022 року рух тролейбусів припинили. Внаслідок збройної агресії рф частину рухомого складу було пошкоджено. Проте вже в травні рух транспорту відновився.